也许每一位从事ELISA检测或者在校医学生在做ELISA实验时都会遇到种种问题，或者在当时不太明白的一些问题，在此，我公司详细讲解一下ELISA实验当中可能遇到的问题和需要注意的事项供大家参考。

ELISA实验目的：ELISA试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中所检测指标的含量。

ELISA实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人所检测指标的 水平。用纯化的所检测指标的t抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入所检测指标的，再与HRP标记的所检测指标的抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成**终的黄色。颜色的深浅和样品中的所检测指标的呈正相关。用酶标仪在150nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人所检测指标的浓度。

注意事项：

1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间比较好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排***加样。

4．请每次测定的同时做标准曲线，比较好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔***孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请***乘以总稀释倍数（×n×5）。

5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物请避光保存。

7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

9．本试剂不同批号组分不得混用。

上海哈研生物科技有限公司拥有良好信誉，高效的实验团队，丰富的实验经验，热情的销售人员专业经销众多国际生命科学领域的**品牌ELISA试剂盒，标准品，细胞，生化试剂，抗体，培养基，血清，实验耗材，实验设备等实验室用品，是您一站式采购王国。为中国科研试剂**供应商之一，质量被全国各大院校科研机构认可，并指定为Elisa试剂盒长期供应商，作为战略合作伙伴。我公司一直秉持着顾客的需要就是我们的动力，我们要满足顾客的所有需求，我们必将以饱满的热情服务每一位顾客，截止在***，我公司已成功完成数以千计的ELISA实验，丰富的经验期待着为您服务！

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elisa实验步骤和每步原理

ELISA酶联免疫吸附实验

1.原理：免疫分析是一种利用特定抗体与抗原或半抗原发生的高选择性高特异性识别和结合原理，对待测抗体或者抗原进行分析测定的方法，酶联免疫吸附分析（下称ELISA）是免疫分析的一种，分三个部分组成：免疫识别，信号输出和数据处理。

2.步骤：免疫识别是在聚苯乙烯制成的96孔板上包被抗体，而后利用抗体识别待测的抗原（通常是疾病的蛋白质生物标记物，病毒，细菌等等，从复杂待测液中将抗原吸附到96孔板表面。接着用带有辣根过氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）、荧光或放射性标记的抗体通过直接或者间接的方式输出识别信号。最后利用信号强度，标准样品浓度梯度等信息计算得出待测样中目标抗原的浓度。

3.分类：根据免疫识别和信号输出方式的不同，ELISA可以分为双抗体夹心法、直接免疫竞争法和非直接免疫竞争法等等。其中双抗体夹心法在商业应用上最常见。

双抗体夹心法：

①：抗体包被 在96孔板上包被抗体。由于酶标板是由聚苯乙烯制成，其含有的苯环与抗体的氨基酸残基具有类似π-π堆积作用的引力，结合静电和疏水作用，可以将抗体吸附于其表面。然后，将未吸附的抗体用缓冲液清洗后，加入含有明胶或牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）的封闭液以封闭酶标板上未结合抗体的部分。加入封闭液的目的，是防止其他蛋白因静电或疏水作用吸附在96孔板上，造成假阳性信号，干扰后续实验的进行。

②：免疫识别 在96孔板上包被抗体后，加入待测样，并在37°C环境下孵育一段时间，通常是1-2小时。此时酶标板上的抗体与待测抗原进行特异性识别结合。此处抗体的质量是关键，好的抗体既能特异性高效地结合抗原又不受待测样中其他生物大分子、蛋白质和无机盐等成分的影响。

③：洗板 将未结合的抗原洗掉，加入该抗原所对应的识别抗体并在37°C下继续培养1-2小时，接着将未连接上抗原的抗体洗掉。

④：酶标信号输出 加入带有辣根过氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）标记的酶标二抗，用于和标准抗体结合。在培养30分钟后洗掉未连接的二抗，并加入显色剂显色。根据显色的结果判断抗原的浓度。一般认为，抗原浓度与显色后的发光强度呈正相关。

免疫竞争法

以抗原竞争抗体为例，在上述免疫夹心法操作步骤的第二步加入待测抗原后，立刻加入酶标抗原，使之与待测抗原竞争识别酶标板上的抗体。当待测抗原浓度越高，能够连上酶标板上抗体的酶标抗体就越少，输出的信号就越少。这样待测样浓度与酶显色信号就呈逆相关。

elisa实验步骤

elisa实验步骤如下

方法一，用于检测未知抗原的双抗体夹心法

1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。

2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

方法二，用于检测未知抗体的间接法

用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。

(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

elisa实验原理及步骤是什么？

ELISA实验原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。

酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色氧化型，出现颜色反应。

因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。

ELISA实验步骤及注意事项:

1、固相载体选择

聚苯乙烯：具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。

聚氯乙烯：聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。

良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。

2、包被

①板孔的选择：ELISA级别的微孔板。

②抗体选择：选择支持ELISA实验的抗体，根据推荐浓度稀释或摸索最适浓度。

③包被缓冲液：pH9.6碳酸盐缓冲液或pH7.2磷酸盐缓冲液。

④包被温度：2-8 ℃过夜包被或室温（37℃）包被2h。

⑤包被浓度：包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化。一般包被浓度为10ug/ml-20ug/ml。

3、封闭

①包被之后一定要立即封闭（封闭非特异性抗体）。

②选择效果较好的封闭剂（细胞培养级BSA、Tween等）。

4、加样及孵育

①加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。

②孵育的时间及温度参考试剂盒说明书。如有条件，建议加样孵育时使用shaker震荡仪，推荐轨道直径3mm，转速在500±50rpm。

③检测抗体、酶标物的稀释比例、孵育温度、孵育时间严格根据说明书提示。

④洗板对于ELISA来说，是极其关键的一步，保证ELISA的特异性。

⑤封板膜一定要一次一换，切勿二次甚至多次使用，以防交叉污染。

5、显色和终止

①使用前需检查，底物在加入96孔板之前应为无色透明。

②显色底物需现配现用，避免污染。

③孵育时间，说明书上为参考范围，具体需要根据实验条件自行摸索。可参考标曲浓度最大孔的颜色，变为蓝色较明显时即可。